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    2. 知識大講堂

      >常見問題
      基因敲除小鼠檢測金標準 ——Southern blot檢測
      在制備基因敲進和條件性基因敲除模式小鼠過程中,Southern blot檢測是非常重要的一步。依據我們大量的數據統計分析,采用ES細胞方式制備,大約有20%的概率有隨機插入;采用CRISPR/Cas9技術,大約有35%的概率有隨機插入。而隨機插入必須通過Southern blot才能排除。做模式動物的朋友,一定要讓你的服務商做Southern blot,否則你大量的時間和金錢投入可能化為烏有。
      基因敲除小鼠三項檢測標準
      打靶策略和試驗方法,在確定設計時就應該是沒有什么問題的。拿到基因敲除小鼠的時候需要特別注意問題就是質控標準?;蚯贸∈笾苽溥^程中,檢測標準有三項不可缺少:核型檢測、PCR鼠尾檢測、Southern檢測。 核型檢測是取陽性克隆的細胞,分析細胞的核型。目的是為了排除染色體異常使小鼠出現表型,從而避免試驗錯誤;PCR檢測是利用目標片段上、下游引物,擴增出特定位置條帶的反應。驗證了目的片段有沒有整合到對應的基因組中。Southern blot雜交是進行基因組DNA特定序列定位的方法,其操作過程是利用電泳分離經酶消化后的DNA片段,然后在將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上,經干烤或者紫外線照射固定,再與相對應結構的DIG標記探針進行雜交,用放射自顯影或酶反應顯色,從而檢測特定DNA分子的含量。Southern雜交的目的是為了檢測目的基因的插入位置及拷貝數量。 如果經過這三項檢測,均獲得陽性結果,基本就可以確認得到的基因敲除小鼠基因型是沒有問題的。
      動物房環境影響小鼠飼養的三大要素
      最近好多老師咨詢小鼠飼養的問題,還有一些老師想要籌建動物房,經常參加百奧賽圖的小鼠飼養培訓課程。百奧賽圖“海門動物中心”已投入使用,沒有精力飼養小鼠的老師提供大小鼠代養服務。那么,飼養小鼠需要注意哪些要素呢?下面我們將介紹動物房環境影響小鼠飼養的三大因素,老師們快來對號入座,看看自己的動物房達標了么? 小鼠天性膽小,易受驚,對外界環境的改變極為敏感,所以動物房的環境對小鼠飼養的影響是最直接的,而影響因素中最重要的三要素就是動物房的溫度、濕度和空氣清潔度。溫度是影響小鼠生理的一個關鍵因素,也是飼養小鼠需要重點關注的因素。在一定范圍內,溫度變動緩慢,機體可以本能地進行調節與之適應,但變化過大或過急,機體將產生行為和生理不良等影響,影響實驗結果。 一般哺乳類實驗動物,當溫度過低時,常導致性周期的推遲,而溫度超過30℃時,雄性動物會出現睪丸萎縮,產生精子的能力下降;雌性動物會出現性周期的紊亂,泌乳能力下降或拒絕哺乳,妊娠率下降。因此實驗環境溫度過高或過低,都能導致機體抵抗力下降,使動物易于患病,影響實驗結果的正確性,甚至造成動物死亡。經長期實踐,大家發現動物實驗時最適宜的環境溫度為21~27℃。 濕度是動物房環境影響小鼠飼養的一個重要因素。濕度過高,微生物易于繁殖,危害極大;濕度過低(如低于40%)容易導致灰塵飛揚,對動物的健康極其不利??諝獾南鄬穸?,也與動物的體溫調節有密切關系,在高溫情況下影響尤為明顯。在低濕度條件下,小鼠和大鼠的哺乳雌鼠常發生吃仔現象,此外仔鼠也常會出現發育不良。所以濕度問題我們需要密切留意。 人類的空氣已出了大問題,動物房的空氣可不能出一點問題,因為小鼠可比人類嬌氣多了??諝庵邪钡暮渴呛饬靠諝赓|量的指標,勞動衛生標準對空氣中氨濃度的限度,在實驗動物房要求不超過20ppm。動物糞便和腸中產生的臭氣中含有H2S ,室內H2S濃度增高會使動物妊娠率下降。此外,濃厚的雄性小鼠汗腺分泌物和臭氣,也會使雌性小鼠性周期紊亂。 因此,動物飼養室和動物實驗室的空氣應盡量保持新鮮,注意通風換氣;要求氨濃度小于20ppm,氣流速度10~25cm/s,換氣次數10~15次/小時。 另外,光照,噪聲以及鼠籠墊料也是動物房環境的重要影響因素。小鼠科研貢獻大,飼養也是馬虎不得,需要專業的環境、專業的飼養人員等,實在沒有條件自己飼養小鼠的老師,可以尋找有實力、有資質的提供大小鼠代養服務的公司代養!
      EGE系統與CRISPR/Cas9技術相比有哪些優勢
      CRISPR/Cas9技術應用于基因點突變、?敲入時都是基于基因組的同源重組,普通CRISPR/Cas9技術介導的外源DNA的同源重組效率一直很低。而百奧賽圖在CRISPR/Cas9技術基礎上開發的EGE系統通過一系列的創新和優化,其同源重組效率與普通CRISPR/Cas9技術相比提高了10-20倍,使得基因改造效率更高,生產周期更短,更加快速和方便。
      小鼠為什么能成為最好的模式動物
      在基礎生命科學研究領域,不可或缺的研究工具就是模式動物。所謂模式動物是指用各種方法把需要研究的生理或病理活動相對穩定地展示出來的標準化的實驗動物。一般用于實驗的模式動物有很多,例如:斑馬魚、果蠅、大鼠、小鼠等。其中,最好、使用最廣泛的模式動物是小鼠。那么小鼠為什么能成為最好的模式動物呢?這主要取決于以下四方面; 1、 小鼠的基因組計劃已基本完成?;蚪M序列的大量信息為研究基因功能及其表達調控、胚胎發育和人類疾病的分子機制提供了條件基礎和技術手段; 2、 小鼠生理生化和發育過程和人類相似,基因組和人類98%同源,所以很多小鼠疾病模型可以基本上真實的模擬人類疾病的發病過程及對藥物的反應; 3、 小鼠的基因改造技術成熟;從上世紀七八十年代基因改造技術誕生以來到最新的技術突破,基因改造技術在小鼠模型構建方面日趨完善。美國科學家MarioR.Capecchi、OliverSmithies和英國科學家MartinJ.Evans因“涉及使用胚胎干細胞進行小鼠特定基因修飾方面的一系列突破性發 現” 而獲得2007年度諾貝爾生理學或醫學獎。 4、小鼠繁殖能力強,性成熟早,體型小巧且易于管理,用于實驗更加方便快捷。
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